洁净厂房 | 菌种保藏-无菌检验、微生物限度检验

1.挑选特征典型的纯菌菌落。方法是用接种环挑取少许菌苔，接种至2ml营养肉汤或0.9%氯化钠溶液中制成菌液，再取一环菌液在营养琼脂平板上分区划线，培养后可见单个菌落生长。

2.凡能产生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢进行保种。孢子和芽胞的代谢作用较弱，但对恶劣环境有很强的抵抗。在传代前，将菌液管放入80℃水浴中作用30分钟，杀死杂菌繁殖体后用芽孢传代。 

3.定期对保藏菌种进行检查、分离、纯化，以防菌种变异及衰退，检查项目包括菌落形态、染色、镜检、生化特性及血清学检查。

4.选择适宜的培养基及保藏方法。

二、常用菌种的保藏方法

1.普通琼脂斜面  用于常用菌株的传代。在营养琼脂培养基内按0.5%加入琼脂粉配制而成。接种培养后，将菌种管用硅胶塞塞紧，置4℃冰箱保存，每隔2～3个月传种1次。铜绿假单孢菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，其菌种须放25℃培养箱内保存。

2.半固体琼脂  用于常用菌株的传代。在营养肉汤培养基内按0.5%加入琼脂粉配制而成。穿刺接种培养后，置4℃冰箱保存，6个月传种1次。如在培养管内加少量无菌液体石蜡隔绝空气，减少水分蒸发，可延长菌种的保藏期。

3.真菌琼脂斜面  用于真菌的传代。在真菌培养基内按1.3%加入琼脂粉配制而成。划线接种后，20～25℃培养24小时，置4℃冰箱保存，3～6个月传种1次。

4.沙氏琼脂斜面  用于真菌的传代。配方：蛋白胨10g ，葡萄糖10g，琼脂粉13g，加蒸馏水1000ml，待上述成分溶化后，摇匀分装，115℃灭菌20分钟，趁热摆成斜面。划线接种后，20～25℃培养24小时，置4℃冰箱保存，3～6个月传种1次。 

5. 40％甘油水  用于细菌的传代。配制方法：甘油40ml加水至100ml即成。分装至试管内，每支2ml左右，121℃灭菌20分钟备用。接种细菌后直接放4℃冰箱保存，6～12个月传代1次。 

6.需气菌、厌气菌培养基  用于生孢梭菌的传代。取生孢梭菌CMCCB64941菌液1ml至需气菌、厌气菌培养基15ml内，30～35℃培养18～24h，置4℃冰箱内保存3～6个月传种1次。 

7. 疱肉培养基  用于破伤风梭菌的传代。取破伤风梭菌CMCCB64067菌液0.1ml接种于疱肉培养基内，36℃±1℃厌氧培养3～4天，置4℃冰箱保存，6～12个月传代1次。 

8. 液氮超低温保藏法  适用于各类微生物的保藏。液氮温度可达-196℃，此时菌种的新陈代谢活动已停止，但不会死亡。在配制好的菌液内加10％甘油作为保护剂，分装于安瓿中，置液氮罐内可保存10年之久。

9.冷冻真空干燥保藏法  本法广泛适用于各类微生物的保藏，包括病毒和噬菌体。将菌液混于有保护作用的介质内，分装于灭菌菌种管内，速冻后抽真空，使菌液很快变为疏松的干燥菌粉，最后在真空状态下密封管口，菌种保存期最长可达20年以上。

三、菌种检查与复壮

菌种在传代保藏过程中，易发生衰退、变异、污染和死亡，因此必须定期检查。将菌种接种至液体培养基内使之复活，重新分离，纯化形成单个菌落，再作菌种鉴定，包括菌落形态、颜色，染色性、镜下观察菌体形态等，必要时可做生化试验及血清学反应。

菌种经人工传代保藏过程中，由于自发突变而引起特性变弱或消失往往为菌种衰退。使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性，称为菌种复壮。常用方法有：

①分离纯化：将菌种接种至营养肉汤培养基培养24小时，取菌液在营养琼脂平板上分区划线，培养后挑取典型单个菌落。 

②宿主复壮：将退化菌种接种到相应昆虫或动植物宿主体内，传种数代可恢复其原有的特性与毒力。

③抗逆复壮：通过极端的逆境处理使那些退化的细菌死亡，选育健壮的传代保种。

四、实验菌种的管理

菌种应放入专用冰箱，实行双人、双锁保管。菌种应有购入记录，传代记录，领用记录和销毁记录。菌种应定期检查、分离、纯化，以防菌种变异及衰退。菌种传代应不超过五代。 

五、细胞冻存与复苏

细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化，因此及时进行细胞冻存十分必要。

1.为避免污染造成的损失，在冻存细胞前，应该检查细胞是否污染以及细胞的密度和细胞的活力。

2.细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，经实验证明这样可以最大限度的保存细胞的活力。缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶的形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

3.操作步骤

（1）细胞冻存

a.配制含10%DMSO、10-20%小牛血清的冻存细胞培养液；

b.用胰蛋白酶将选好的细胞消化下来，消化时一定要掌握好消化的时间，如果时间处理不当，就会导致细胞的死亡，且细胞瓶中的胰酶残留尽量倒干净；

c.将消化好的细胞加入适量配制好的冻存培养液，用注射器或吸管轻轻吹打使细胞均匀；

d.将细胞悬液分装入冻存管中，每管1~1.5ml；

e.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

f.冻存的过程：将冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱过夜，取出冻存管移入液氮容器内。

（2）细胞复苏

a.佩戴厚点的手套，从液氮罐中取出冻存管快速直接放入37℃温水中，并不时摇动使其在1分钟内快速融解；

b.在无菌下从水浴中取出冻存管，冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管或注射器吸出细胞悬液注入离心管中，由于离心管中细胞悬液较少所以再加入适量的培养液混匀；

c.离心，在1000rpm离心5min；

d.将离心管取出，弃去上清液，向离心管中加入含10%小牛血清细胞培养液用吸管或注射器吹打后接种于培养瓶，37℃培养箱静止置培养；

f.7~8小时后换液继续培养。

4.注意事项

（1）由于冻存的细胞还受其他因素影响，因此可能有部分死亡细胞，此时在换液时可将不贴壁和漂浮在培养液上已死亡的细胞轻轻倒掉，再补充新的培养液；

（2）冻存和复苏细胞时最好用新配制的培养液；

（3）冻存管存取时一定要做好防护工作，以免冻伤。